Nuevos conocimientos sobre estados oscuros mejoran la imagen.

MadridInvestigadores del St. Jude Children's Research Hospital han mejorado un método para medir distancias diminutas utilizando transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de una sola molécula (smFRET). Esta técnica sigue cómo ciertas sustancias, llamadas fluoróforos, emiten luz. Los fluoróforos brillan cuando sus electrones excitados se calman tras ser energizados. Sin embargo, en ocasiones estos fluoróforos dejan de emitir luz y entran en un estado conocido como estados oscuros tripletes, lo que puede hacer que las mediciones de smFRET sean menos precisas y exactas.

Los científicos de St. Jude han desarrollado nuevas formas de gestionar la duración de los estados oscuros en la imagenología molecular. Esto hace que el proceso de imagen sea más claro y preciso. Compartieron sus resultados en la revista Nature Methods.

El estudio reveló que los fluoróforos a menudo no emiten luz porque entran en un estado no fluorescente conocido como estado oscuro triple. Esto los hace menos brillantes, lo que puede afectar negativamente las mediciones de FRET de molécula única. No obstante, las tecnologías de autorreparación pueden reducir estos estados oscuros, mejorando significativamente la resolución de las imágenes.

Comprender el movimiento de las moléculas es crucial para conocer el funcionamiento de la biología. La técnica llamada smFRET permite a los científicos observar estos movimientos en tiempo real. El Dr. Scott Blanchard, de los departamentos de Biología Estructural y Biología Química y Terapéutica de St. Jude, está mejorando la imagenología smFRET. Su equipo ha creado fluoróforos especiales para medir estos eventos moleculares con mayor precisión.

El equipo de Blanchard necesitaba mejores métodos para medir a escala molecular, por lo que crearon sus propias moléculas fluorescentes especiales. Descubrieron que las moléculas fluorescentes estándar debían ser modificadas fundamentalmente para funcionar correctamente. Para la técnica FRET de una sola molécula (smFRET), los científicos adhieren dos moléculas fluorescentes a diferentes partes de una biomolécula. Luego, un láser excita la primera molécula, que transfiere energía a la segunda si está lo suficientemente cerca, provocando que emita luz. Estos destellos de luz son esenciales para medir distancias a nivel molecular.

Los fluoróforos emiten luz en función de los estados de espín de los electrones. Normalmente, un electrón excitado regresa a su estado de espín original al relajarse. Sin embargo, en ocasiones, el electrón cambia a un estado de espín diferente y entra en un estado triplete duradero que no emite luz. Este inconveniente reduce el brillo de los fluoróforos y afecta la capacidad del smFRET para medir distancias con precisión.

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En la técnica FRET de molécula única, tanto los colorantes donantes como aceptores deben comportarse de manera similar. Sin embargo, los estados oscuros tripletes generan diferencias que disminuyen la calidad de los datos. Para solucionar esto, la ingeniería de fluoróforos se enfoca en reducir la duración de estos estados tripletes.

Las tecnologías de autorreparación abordan este problema. Soluciones anteriores, como el Ciclooctatetraeno, enfrentaban desafíos como la baja solubilidad. El equipo de Blanchard creó fluoróforos con Ciclooctatetraeno, logrando fluoróforos autorreparadores que redujeron significativamente el tiempo en estados tripletes.

El uso de fluoróforos auto-reparables en smFRET mejora la calidad y fiabilidad de los datos. Esto mantiene una alta calidad de imagen incluso cuando se incrementa la intensidad del láser. Estas mejoras amplían las capacidades de smFRET y tienen diversas aplicaciones a nivel mundial.

Las fluoróforos autoluminiscentes brindan ventajas significativas: son más brillantes y estables bajo la luz. Además, ofrecen mejor resolución espacial y temporal para la imagen FRET de molécula única. Esto permite obtener detalles a escala nanométrica en milisegundos y funciona eficazmente en condiciones normales de oxígeno.

Blanchard cree que estos hallazgos ayudarán a los investigadores en St. Jude y otros lugares. Los marcadores fluorescentes autorreparables forman parte de los planes de St. Jude y podrían mejorar muchas aplicaciones de fluorescencia. Esta nueva tecnología parece prometedora para numerosos avances científicos.