Nya insikter i fluorescerande 'mörka tillstånd' banar väg för förbättrad molekylär avbildning

StockholmForskare vid St. Jude Children's Research Hospital har förbättrat en metod för att mäta små avstånd med hjälp av single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET). Denna teknik följer hur vissa ämnen, kallade fluoroforer, avger ljus. Fluoroforer lyser när deras exciterade elektroner återgår till ett lugnt tillstånd efter att ha fått energi. Ibland slutar dock dessa fluoroforer att avge ljus och går in i ett tillstånd kallat tripletmörkertillstånd, vilket kan göra smFRET-mätningar mindre exakta och precisa.

Forskare vid St. Jude har utvecklat nya metoder för att hantera längden på mörka tillstånd vid molekylär avbildning. Detta gör avbildningsprocessen tydligare och mer exakt. De publicerade sina resultat i tidskriften Nature Methods.

Studien visade att fluoroforer ofta misslyckas med att utsända ljus eftersom de hamnar i ett icke-fluorescerande tillstånd kallat ett triplett mörkt tillstånd. Detta gör dem svaga, vilket kan ha en negativ inverkan på FRET-mätningar av enskilda molekyler. Självläkande teknologier kan dock minska dessa mörka tillstånd avsevärt, vilket förbättrar upplösningen vid avbildning markant.

Att förstå hur molekyler rör sig är viktigt för att veta hur biologin fungerar. Tekniken smFRET gör det möjligt för forskare att observera dessa rörelser i realtid. Dr. Scott Blanchard från St. Judes avdelningar för strukturell biologi och kemisk biologi & terapi förbättrar smFRET-bildtekniken. Hans team har utvecklat särskilda fluoroforer för att mäta dessa molekylära händelser mer exakt.

Blanchards team behövde bättre metoder för att mäta på molekylär nivå, så de skapade egna fluorescerande molekyler. De upptäckte att vanliga fluorescerande molekyler måste ändras i grunden för att fungera korrekt. För smFRET (single-molecule FRET) fäster forskare två fluorescerande molekyler på olika delar av en biomolekyl. En laser exciterar den första molekylen, som överför energi till den andra molekylen om den är tillräckligt nära, vilket får den att avge ljus. Dessa ljusutbrott är avgörande för att mäta avstånd på molekylär nivå.

Fluoroforer avger ljus baserat på elektroners spintillstånd. Vanligtvis återgår en exciterad elektron till sitt ursprungliga spintillstånd när den avspänns. Ibland händer det dock att elektronen byter spintillstånd och går in i ett långvarigt tripletillstånd som inte avger ljus. Detta problem minskar fluoroforers ljusstyrka och påverkar smFRET:s förmåga att mäta avstånd noggrant.

Läs också:

Idag · 09:01

Stamcellstransplantat reparerar makulära hål hos primater framgångsrikt

I single-molekyl FRET är det viktigt att både donor och acceptor färgämnen uppför sig på ett liknande sätt. Triplet mörka tillstånd kan däremot orsaka skillnader som försämrar datakvaliteten. För att åtgärda detta lägger man inom fluoroforutveckling fokus på att förkorta längden på dessa triplet tillstånd.

Självläkande teknologier hanterar detta problem. Tidigare lösningar som cyklooktatetraen mötte utmaningar som dålig löslighet. Blanchards team skapade fluoroforer med cyklooktatetraen, vilket resulterade i självläkande fluoroforer som avsevärt minskade tiden i triplettillstånd.

Genom att använda självhelande fluoroforer i smFRET förbättras datakvaliteten och tillförlitligheten. Detta säkerställer hög bildkvalitet även när laserintensiteten ökar. Dessa förbättringar utvidgar smFRET:s kapaciteter och har olika användningsområden globalt.

Självläkande fluoroforer har stora fördelar: de är ljusare och mer stabila under belysning. De ger också bättre upplösning i både rum och tid för avbildning av enskilda molekyler med FRET. Detta möjliggör detaljnivåer på nanometerskala inom millisekunder och fungerar väl under normala syreförhållanden.

Blanchard anser att dessa upptäckter kommer att vara till nytta för forskare vid St. Jude och på andra platser. Självreparerande lysande markörer ingår i St. Judes planer och kan förbättra många fluorescensapplikationer. Denna nya teknik ser lovande ut för många vetenskapliga genombrott.