Nowe odkrycia w kontroli "ciemnych stanów" fluorescencyjnych poprawiają precyzję obrazowania molekularnego.

WarsawNaukowcy z Dziecięcego Szpitala Badawczego im. St. Jude ulepszyli metodę pomiaru bardzo małych odległości za pomocą techniki zwanej jednocząsteczkowym transferem energii fluorescencyjnej (smFRET). Technika ta śledzi emisję światła przez substancje zwane fluoroforami, które świecą, gdy ich pobudzone elektrony powracają do stanu podstawowego. Jednak fluorofory czasami przestają emitować światło i wchodzą w tak zwane stany ciemne tripletowe, co może zmniejszyć precyzję i dokładność pomiarów smFRET.

Naukowcy z St. Jude opracowali nowe metody zarządzania długością „stanów ciemnych” w obrazowaniu molekularnym. Dzięki temu proces obrazowania staje się wyraźniejszy i bardziej precyzyjny. Wyniki swoich badań opublikowali w czasopiśmie Nature Methods.

Badanie wykazało, że fluorofory często przestają emitować światło, ponieważ wchodzą w stan niefluorescencyjny zwany ciemnym stanem tripletowym. Powoduje to, że stają się mniej intensywne, co może negatywnie wpływać na pomiary FRET pojedynczych cząsteczek. Jednak technologie samonaprawy mogą zmniejszyć liczbę tych ciemnych stanów, znacznie poprawiając rozdzielczość obrazowania.

Zrozumienie, jak poruszają się cząsteczki, jest kluczowe dla poznania, jak działa biologia. Technika, znana jako smFRET, pozwala naukowcom obserwować te ruchy w czasie rzeczywistym. Dr Scott Blanchard z działów Biologii Strukturalnej oraz Biologii Chemicznej i Terapii w St. Jude's pracuje nad udoskonaleniem obrazowania smFRET. Jego zespół stworzył specjalne fluorofory, aby dokładniej mierzyć te wydarzenia molekularne.

Zespół Blancharda potrzebował lepszych metod do pomiarów na poziomie molekularnym, więc stworzyli własne, specjalne cząsteczki fluorescencyjne. Odkryli, że standardowe cząsteczki fluorescencyjne muszą zostać zasadniczo zmienione, aby działały poprawnie. W technice pojedynczej cząsteczki FRET (smFRET) naukowcy przyłączają dwie cząsteczki fluorescencyjne do różnych części biomolekuły. Laser pobudza pierwszą cząsteczkę, która przekazuje energię do drugiej, jeśli jest wystarczająco blisko, co powoduje, że emituje ona światło. Te impulsy świetlne są kluczowe do mierzenia odległości na poziomie molekularnym.

Fluorofory emitują światło w oparciu o stany spinowe elektronów. Zazwyczaj, wzbudzony elektron wraca do swojego pierwotnego stanu spinowego podczas relaksacji. Czasami jednak elektron zmienia stan spinowy i wchodzi w długotrwały stan tripletowy, który nie emituje światła. To zjawisko obniża jasność fluoroforów i wpływa na precyzję pomiarów odległości metodą smFRET.

Zobacz również:

Dzisiaj · 09:01

Przełom: komórki macierzyste naprawiają dziury w siatkówce małp

W technice FRET na pojedynczych cząsteczkach ważne jest, aby barwniki donorowy i akceptorowy zachowywały się w podobny sposób. Niestety, obecność stanów ciemnych tripletowych prowadzi do różnic, które obniżają jakość danych. Aby temu zaradzić, inżynieria fluoroforów koncentruje się na skracaniu czasu trwania tych stanów tripletowych.

Technologie samonaprawiające rozwiązują ten problem. Starsze rozwiązania, takie jak cyklooktatetraen, miały trudności, np. z niską rozpuszczalnością. Zespół Blancharda stworzył fluorofory z użyciem cyklooktatetraenu, co zaowocowało samonaprawiającymi się fluoroforami, które znacznie skróciły czas przebywania w stanach tripletowych.

Zastosowanie fluoroforów samonaprawiających się w technice smFRET poprawia jakość i wiarygodność danych. Dzięki temu jakość obrazu pozostaje wysoka nawet przy zwiększonej intensywności lasera. Te udoskonalenia rozszerzają możliwości smFRET i znajdują różnorodne zastosowania na całym świecie.

Samonaprawiające się fluorofory mają istotne zalety: są jaśniejsze i bardziej stabilne pod wpływem światła. Dają również lepszą rozdzielczość przestrzenną i czasową w obrazowaniu FRET pojedynczych cząsteczek. Umożliwia to uzyskanie szczegółów na skali nanometrowej w ciągu milisekund i działa dobrze w normalnych warunkach tlenowych.

Blanchard uważa, że te odkrycia mogą wspomóc badaczy w St. Jude oraz w innych miejscach. Naprawiające się samoczynnie znaczniki fluorescencyjne są częścią planów St. Jude i mogą udoskonalić wiele zastosowań fluorescencji. Ta nowa technologia wydaje się obiecująca dla wielu przełomów naukowych.