Novas descobertas sobre estados escuros fluorescentes aprimoram técnicas de imagem molecular eficiente.

São PauloPesquisadores do Hospital de Pesquisa Infantil St. Jude aprimoraram um método para medir distâncias minúsculas usando transferência de energia por ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET). Essa técnica monitora como certas substâncias, chamadas fluoróforos, emitem luz. Os fluoróforos brilham quando seus elétrons excitados se acalmam após serem energizados. No entanto, às vezes esses fluoróforos param de emitir luz e entram em um estado conhecido como estados escuros triplet, o que pode tornar as medições de smFRET menos precisas e exatas.

Cientistas do St. Jude desenvolveram novas técnicas para controlar a duração dos estados escuros na imagem molecular. Isso torna o processo de imagem mais claro e preciso. Eles publicaram os resultados na revista Nature Methods.

O estudo descobriu que os fluoróforos frequentemente falham em emitir luz porque entram em um estado não fluorescente chamado de estado triplete escuro. Isso os torna pouco brilhantes, o que pode impactar negativamente as medições de FRET de molécula única. No entanto, tecnologias de auto-recuperação podem reduzir esses estados escuros, melhorando significativamente a resolução de imagem.

Compreender o movimento das moléculas é fundamental para entender o funcionamento da biologia. A técnica chamada smFRET permite que os cientistas observem esses movimentos em tempo real. O Dr. Scott Blanchard, dos departamentos de Biologia Estrutural e Biologia Química & Terapêutica do St. Jude, está aprimorando a imagem de smFRET. Sua equipe desenvolveu fluoróforos especiais para medir esses eventos moleculares com mais precisão.

A equipe de Blanchard precisava de melhores formas de medir em escala molecular, então criaram suas próprias moléculas fluorescentes especiais. Eles descobriram que as moléculas fluorescentes padrão precisavam ser fundamentalmente modificadas para funcionar corretamente. No método FRET de molécula única (smFRET), os cientistas anexam duas moléculas fluorescentes a diferentes partes de uma biomolécula. Um laser excita a primeira molécula, que transfere energia para a segunda molécula se ela estiver suficientemente próxima, fazendo com que ela emita luz. Esses flashes de luz são essenciais para medir distâncias a nível molecular.

Os fluoróforos emitem luz com base nos estados de spin dos elétrons. Normalmente, um elétron excitado retorna ao seu estado de spin original ao relaxar. No entanto, às vezes o elétron muda para um estado de spin diferente e entra em um estado de triplete prolongado que não emite luz. Esse problema reduz a luminosidade dos fluoróforos e afeta a capacidade do smFRET em medir distâncias com precisão.

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No estudo de FRET de molécula única, tanto os corantes doadores quanto os acceptores precisam se comportar de maneira similar. No entanto, estados escuros de tripletos criam diferenças que reduzem a qualidade dos dados. Para solucionar isso, a engenharia de fluoróforos se concentra em reduzir a duração desses estados tripletos.

Tecnologias de autorreparação visam resolver esse problema. Soluções mais antigas, como o Ciclooctatetraeno, enfrentavam desafios como baixa solubilidade. A equipe de Blanchard criou fluoróforos com Ciclooctatetraeno, resultando em fluoróforos autorreparáveis que reduziram significativamente o tempo gasto em estados tripletos.

O uso de fluoróforos autorreparáveis em smFRET aprimora os dados, tornando-os mais precisos e confiáveis. Isso mantém a qualidade da imagem alta, mesmo quando a intensidade do laser é aumentada. Essas melhorias ampliam as capacidades do smFRET e têm diversas aplicações ao redor do mundo.

Fluoróforos auto-regenerativos oferecem benefícios significativos: são mais brilhantes e mais estáveis sob luz. Além disso, fornecem uma resolução espacial e temporal superior para a imagem de FRET de molécula única. Isso possibilita obter detalhes em escala nanométrica em questão de milissegundos e funciona bem em condições normais de oxigênio.

Blanchard acredita que essas descobertas beneficiarão os pesquisadores do St. Jude e de outros lugares. Marcadores fluorescentes autorreparadores fazem parte dos planos do St. Jude e podem melhorar muitas aplicações de fluorescência. Essa nova tecnologia parece promissora para diversos avanços científicos.