Neue Erkenntnisse über fluoreszierende Dunkelzustände verbessern die Bildgebung

BerlinForscher am St. Jude Children's Research Hospital haben eine Methode zur Messung winziger Abstände mit der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (smFRET) verbessert. Diese Technik verfolgt, wie bestimmte Substanzen, sogenannte Fluorophore, Licht aussenden. Fluorophore leuchten, wenn ihre angeregten Elektronen nach einer Energieladung wieder zur Ruhe kommen. Allerdings hören Fluorophore manchmal auf, Licht abzugeben und gelangen in einen Zustand, der als Triplett-Zustand bezeichnet wird, was die Messungen mit smFRET weniger präzise und genau machen kann.

Wissenschaftler von St. Jude haben neue Methoden entwickelt, um die Dauer von „dunklen Zuständen“ in der molekularen Bildgebung zu steuern. Dies führt zu klareren und präziseren Bildgebungen. Ihre Ergebnisse veröffentlichten sie in der Zeitschrift Nature Methods.

Die Studie ergab, dass Fluorophore oft kein Licht emittieren, weil sie in einen nicht-fluoreszierenden Zustand, den sogenannten Triplett-Dunkelzustand, übergehen. Dies führt dazu, dass sie weniger hell sind, was die Einzelmolekül-FRET-Messungen negativ beeinflussen kann. Allerdings können Selbstheilungstechnologien diese Dunkelzustände verringern und somit die Bildauflösung erheblich verbessern.

Das Verständnis der Molekülbewegungen ist entscheidend für das Wissen, wie die Biologie funktioniert. Mit der Technik namens smFRET können Wissenschaftler diese Bewegungen in Echtzeit beobachten. Dr. Scott Blanchard aus den Abteilungen für Strukturelle Biologie und Chemische Biologie & Therapeutik bei St. Jude verbessert die smFRET-Bildgebung. Sein Team hat spezielle Fluorophore entwickelt, um diese molekularen Ereignisse genauer zu messen.

Blanchards Team benötigte bessere Methoden zur Messung auf molekularer Ebene, daher entwickelten sie eigene spezielle fluoreszierende Moleküle. Sie fanden heraus, dass herkömmliche fluoreszierende Moleküle grundlegend verändert werden mussten, um richtig zu funktionieren. Bei der Einzelmolekül-FRET (smFRET) befestigen Wissenschaftler zwei fluoreszierende Moleküle an unterschiedlichen Teilen eines Biomoleküls. Ein Laser regt das erste Molekül an, welches Energie auf das zweite Molekül überträgt, wenn es nahe genug ist, und dadurch Licht emittiert. Diese Lichtimpulse sind entscheidend für die Messung von Distanzen auf molekularer Ebene.

Fluorophore emittieren Licht auf Basis von Elektronenspin-Zuständen. Normalerweise kehrt ein angeregtes Elektron in seinen ursprünglichen Spinzustand zurück, wenn es sich entspannt. Gelegentlich schaltet das Elektron jedoch in einen anderen Spinzustand und gelangt in einen langlebigen Triplett-Zustand, der kein Licht emittiert. Dieses Problem verringert die Helligkeit der Fluorophore und beeinträchtigt die Genauigkeit von smFRET bei der Abstandsmessung.

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Beim Einzelmolekül-FRET müssen sowohl Donor- als auch Akzeptorfarbstoffe ähnlich reagieren. Triplet-Zustände führen jedoch zu Unterschieden, die die Datenqualität beeinträchtigen. Um dieses Problem zu beheben, konzentriert sich das Fluorophor-Engineering darauf, die Dauer dieser Triplet-Zustände zu verkürzen.

Selbstheilende Technologien bieten eine Lösung für dieses Problem. Frühere Ansätze wie Cyclooctatetraen hatten Schwierigkeiten, wie etwa eine geringe Löslichkeit. Das Team um Blanchard entwickelte Fluorophore mit Cyclooctatetraen, was zu selbstheilenden Fluorophoren führte, die die Verweildauer in Triplett-Zuständen erheblich verkürzten.

Der Einsatz selbstheilender Fluorophore in der smFRET-Technik verbessert die Datenqualität und erhöht die Zuverlässigkeit. Dadurch bleibt die Bildqualität auch bei erhöhter Laserintensität hoch. Diese Fortschritte erweitern die Möglichkeiten der smFRET-Technologie und finden weltweit vielfältige Anwendungen.

Selbstheilende Fluorophore bieten erhebliche Vorteile: Sie sind heller und lichtstabiler. Zudem ermöglichen sie eine bessere räumliche und zeitliche Auflösung für Single-Molecule FRET-Imaging. Dies erlaubt Details im Nanometerbereich innerhalb von Millisekunden und funktioniert gut unter normalen Sauerstoffbedingungen.

Blanchard glaubt, dass diese Erkenntnisse den Forschern von St. Jude und anderenorts helfen werden. Selbstreparierende fluoreszierende Marker sind Teil der Pläne von St. Jude und könnten viele fluoreszenzbasierte Anwendungen verbessern. Diese neue Technologie scheint vielversprechend für zahlreiche wissenschaftliche Durchbrüche zu sein.