Nieuwe inzichten in 'donkere toestanden' verbeteren beeldvormingstechnieken

AmsterdamOnderzoekers bij het St. Jude Children's Research Hospital hebben een methode verbeterd om zeer kleine afstanden te meten met behulp van single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET). Deze techniek volgt hoe bepaalde stoffen, fluoroforen genaamd, licht uitstralen. Fluoroforen beginnen te gloeien wanneer hun aangeslagen elektronen weer tot rust komen na opgewonden te zijn. Echter, soms stoppen deze fluoroforen met het uitstralen van licht en komen ze in een toestand die bekend staat als triplet-donkere toestand, wat smFRET-metingen minder precies en accuraat kan maken.

Wetenschappers van St. Jude hebben nieuwe technieken ontwikkeld om de duur van donkere toestanden bij moleculaire beeldvorming te beheersen. Hierdoor wordt het beeldvormingsproces duidelijker en nauwkeuriger. Ze publiceerden hun bevindingen in het tijdschrift Nature Methods.

Uit het onderzoek bleek dat fluoroforen vaak geen licht uitzenden omdat ze in een niet-fluorescente toestand terechtkomen, een zogenaamd triplet-donkere toestand. Hierdoor worden ze zwak, wat een negatief effect kan hebben op FRET-metingen van een enkel molecuul. Zelfhersteltechnologieën kunnen echter deze donkere toestanden verminderen, wat de beeldresolutie aanzienlijk verbetert.

Inzicht in hoe moleculen zich bewegen is cruciaal om te begrijpen hoe biologie werkt. De techniek genaamd smFRET stelt wetenschappers in staat om deze bewegingen in real-time te observeren. Dr. Scott Blanchard van de afdelingen Structurele Biologie en Chemische Biologie & Therapeutica van St. Jude verbetert de smFRET-beelden. Zijn team heeft speciale fluoroforen ontwikkeld om deze moleculaire gebeurtenissen nauwkeuriger te meten.

Blanchards team had betere methoden nodig om op moleculair niveau te meten, dus creëerden ze hun eigen speciale fluorescerende moleculen. Ze ontdekten dat standaard fluorescerende moleculen fundamenteel moesten worden aangepast om goed te functioneren. Voor enkelmolecuul-FRET (smFRET) bevestigen wetenschappers twee fluorescerende moleculen aan verschillende delen van een biomolecuul. Een laser exciteert het eerste molecuul, dat energie overdraagt aan het tweede molecuul als het dichtbij genoeg is, waardoor het licht uitzendt. Deze lichtflitsen zijn wezenlijk voor het meten van afstanden op moleculair niveau.

Fluoroforen zenden licht uit op basis van de spin-toestanden van elektronen. Normaal gesproken keert een aangeslagen elektron terug naar zijn oorspronkelijke spin-toestand wanneer het ontspant. Soms schakelt het elektron echter over naar een andere spin-toestand en komt in een langdurige triplettoestand die geen licht uitzendt. Dit probleem vermindert de helderheid van fluoroforen en beïnvloedt de nauwkeurigheid van smFRET bij het meten van afstanden.

Lees ook:

Vandaag · 11:00

Is de Melkweg een zeldzame kosmische schat?

Bij enkelmolecuul-FRET moeten zowel de donor- als acceptorkleurstoffen zich vergelijkbaar gedragen. Triplet-donkere toestanden veroorzaken echter verschillen die de datakwaliteit verminderen. Om dit op te lossen, richt fluoroforengineering zich op het verkorten van de duur van deze triplettoestanden.

Zelfherstellende technologieën pakken dit probleem aan. Oudere oplossingen zoals cyclooctatetraeen hadden te kampen met uitdagingen zoals slechte oplosbaarheid. Het team van Blanchard creëerde fluoroforen met cyclooctatetraeen, wat resulteerde in zelfherstellende fluoroforen die de tijd in triplettoestanden aanzienlijk reduceerden.

Het gebruik van zelfherstellende fluoroforen in smFRET verbetert de gegevens en maakt ze betrouwbaarder. Hierdoor blijft de beeldkwaliteit hoog, zelfs bij verhoogde laserintensiteit. Deze verbeteringen breiden de mogelijkheden van smFRET uit en hebben diverse toepassingen wereldwijd.

Zelfherstellende fluorofores bieden aanzienlijke voordelen: ze zijn helderder en stabieler onder licht. Bovendien zorgen ze voor een betere ruimtelijke en tijdsresolutie bij enkelmolecuul-FRET-beelden. Dit maakt het mogelijk om details op nanometerschaal binnen milliseconden vast te leggen en functioneert goed onder normale zuurstofomstandigheden.

Blanchard denkt dat deze bevindingen onderzoekers bij St. Jude en elders zullen helpen. Zelfherstellende fluorescerende markers maken deel uit van St. Jude's plannen en kunnen vele toepassingen van fluorescentie verbeteren. Deze nieuwe technologie lijkt veelbelovend voor talrijke wetenschappelijke doorbraken.