Nuove scoperte sui "dark states" fluorescenti migliorano il controllo per un imaging molecolare avanzato.

RomeI ricercatori del St. Jude Children's Research Hospital hanno migliorato un metodo per misurare distanze microscopiche utilizzando la fluorescenza a trasferimento di energia risonante a singola molecola (smFRET). Questa tecnica monitora come certe sostanze, chiamate fluorofori, emettono luce. I fluorofori brillano quando i loro elettroni eccitati ritornano a uno stato di calma dopo essere stati energizzati. Tuttavia, talvolta questi fluorofori smettono di emettere luce ed entrano in uno stato chiamato stato oscuro tripletto, il che può rendere le misurazioni smFRET meno precise e accurate.

Gli scienziati di St. Jude hanno sviluppato nuovi metodi per controllare la durata degli stati oscuri nell'imaging molecolare. Questo rende il processo di imaging più chiaro e preciso. Hanno pubblicato i loro risultati sulla rivista Nature Methods.

Lo studio ha rivelato che i fluorofori spesso non emettono luce perché entrano in uno stato non fluorescente chiamato stato oscuro tripletto. Questo li rende deboli, influenzando negativamente le misurazioni FRET a singola molecola. Tuttavia, le tecnologie di auto-rigenerazione possono ridurre questi stati oscuri, migliorando significativamente la risoluzione dell'immagine.

Comprendere come si muovono le molecole è fondamentale per capire il funzionamento della biologia. La tecnica chiamata smFRET consente agli scienziati di osservare questi movimenti in tempo reale. Il Dott. Scott Blanchard, dei dipartimenti di Biologia Strutturale e Biologia Chimica & Terapie di St. Jude, sta migliorando l'imaging smFRET. Il suo team ha creato fluorofori speciali per misurare con maggiore precisione questi eventi molecolari.

Il team di Blanchard necessitava di metodi migliori per misurare su scala molecolare, così hanno creato proprie molecole fluorescenti speciali. Hanno scoperto che le molecole fluorescenti standard dovevano essere radicalmente modificate per funzionare correttamente. Per il FRET a singola molecola (smFRET), gli scienziati attaccano due molecole fluorescenti a diverse parti di una biomolecola. Un laser eccita la prima molecola, che trasferisce energia alla seconda molecola se abbastanza vicina, facendola emettere luce. Questi impulsi di luce sono essenziali per misurare distanze a livello molecolare.

I fluorofori emettono luce in base agli stati di spin degli elettroni. Normalmente, un elettrone eccitato ritorna al suo stato di spin originale quando si rilassa. Tuttavia, a volte l’elettrone cambia stato di spin entrando in uno stato di tripletto di lunga durata che non emette luce. Questo problema riduce la luminosità dei fluorofori e compromette la capacità dello smFRET di misurare le distanze con precisione.

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Nel FRET a singola molecola, è essenziale che i coloranti donatore e accettore si comportino in modo simile. Tuttavia, gli stati scuri di tripletto creano delle differenze che peggiorano la qualità dei dati. Per risolvere questo problema, l'ingegneria dei fluorofori si concentra sulla riduzione della durata di questi stati di tripletto.

Le tecnologie autoriparanti affrontano questo problema. Le soluzioni precedenti come il Ciclooctatetraene hanno incontrato difficoltà come la scarsa solubilità. Il team di Blanchard ha creato fluorofori utilizzando il Ciclooctatetraene, ottenendo fluorofori autoriparanti che hanno ridotto significativamente il tempo trascorso negli stati tripli.

L'utilizzo di fluorofori auto-rigeneranti nello smFRET migliora la qualità dei dati e li rende più affidabili. Questo permette di mantenere alta la qualità dell'immagine anche quando l'intensità del laser viene aumentata. Tali miglioramenti ampliano le capacità dello smFRET e trovano applicazioni diverse in tutto il mondo.

I fluorofori autorigeneranti offrono notevoli vantaggi: sono più luminosi e stabili sotto la luce. Offrono inoltre una migliore risoluzione spaziale e temporale per l'imaging FRET a singola molecola. Questo consente di ottenere dettagli a scala nanometrica in pochi millisecondi e funziona bene in condizioni normali di ossigeno.

Blanchard ritiene che questi risultati saranno utili per i ricercatori di St. Jude e non solo. I marcatori fluorescenti autoriparanti fanno parte dei progetti di St. Jude e potrebbero migliorare molte applicazioni basate sulla fluorescenza. Questa nuova tecnologia sembra promettente per numerose scoperte scientifiche.